ПРОТЕКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ НА ДЕГРАДАЦИЮ ХРЯЩА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ КУЛЬТУРАХ

ВЕДЕНИЕ
В нескольких исследованиях обращается особое внимание на важность внеклеточных нуклеотидов и нуклеозидов для роста клеток [1–3]. Однако уже в течение нескольких лет известно, что олигодезоксинуклеотиды могут оказывать неспецифическое воздействие на функцию клеток [1–2]. Оно может, по крайней мере частично, проистекать из их способности связывать клеточные белки. Фосфоротиоатные олигодезоксинуклеотиды могут связываться с рекомбинантным растворимым кластером дифференцировки-4 (rsCD4), гликопротеином-120 (gp120) и протеинкиназой C (РКС) вне зависимости от нуклеотидной последовательности [1]. Олигонуклеотиды могут связываться с гепаринсвязывающими белками, прежде всего с основным фактором роста фибробластов (оФРФ) с низкой наномолярной аффинностью. Установлено, что это связывание происходит зависимым от длины и концентрации образом [1–2]. В последнее время было показано, что полидезоксирибонуклеотиды (ПН), смесь дезоксирибонуклеотидных полимеров различной длины (от 50 до 2000 пар оснований), высвобождают оФРФ из их депо в эндотелиальной матрице и защищают оФРФ от расщепления трипсином и химотрипсином и от окисления на воздухе [4]. ПН также могут вызывать пролиферацию фибробластов in vitro, усиливать выработку коллагена и экспрессию сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР) [2–3]. Стимуляция рецепторов аденозина может вызывать экспрессию СЭФР во многих типах клеток, и этого можно достичь стимуляцией А2а-рецептора, или А2b-рецептора, или обоих [3, 5]. Экспериментальные модели предполагают, что ПН может связываться с сосудистым эндотелием, модулировать активность тромбоцитов, способствовать фибринолизу, уменьшать тромбинообразование и снижать уровни циркулирующих ингибиторов активатора плазминогена-1 с усиленным подавлением запрограммированной гибели клеток [6–7]. Известно, что ПН высвобождают ингибиторы пути тканевого фактора из эндотелиальных клеток и повышают концентрации простагландина E2 в плазме, что ингибирует агрегацию тромбоцитов [8–9]. Всего лишь минимальная антикоагулянтная активность, но мощные антитромботический и профибринолитический эффекты как in vitro, так и in vivo наблюдаются после введения ПН [10–12]. Соответственно, эти молекулы применяются в терапии в качестве стимулятора репарации при заболеваниях, характеризующихся тканевыми дефектами, при ишемии нижних конечностей и ожоговых поражениях [13–14]. Кроме того, ПН мощно подавляют гепараназу, которая избыточно экспрессируется в плазматических клетках при множественной миеломе, а также коррелирует с прогрессированием и метастазами сóлидных опухолей [4]. Более того, ПН связываются с коллагеном первого типа с низкой наномолярной аффинностью и могут стимулировать клеточный митогенез и тубулярный морфогенез в трехмерных гелях коллагена-I [15].

ПН могут способствовать восстановлению благоприятной осмотической микросреды в суставной полости, но фармакологически они являются исключительно сложным веществом, и их действие может сильно зависеть от состояния внеклеточного или суставного микроокружения [17]. Изменения осмотической среды вызывают изменения в объеме изолированных клеток и клеток тканевых эксплантатов. Известно, что при заболеваниях хряща, таких как остеоартрит (OA), среда становится гипоосмотической [18]. Однако неизвестно, как клетки здорового хряща реагируют на провокацию гипоосмолярностью [18].

Иммунофлуоресценция.

На 30-й день инкубации исследовали клетки, экстрагированные из биоптатов. Иммуноцитохимическим анализом хондроцитов, выделенных из биоптатов, обнаружено, что у всех образцов, выдержанных в питательной среде с 2% ПН, уровень экспрессии коллагена II типа и аггрекана (табл. 3) был повышен по сравнению с другими образцами и контролями.

Тканевые срезы:
окрашивание гематоксилином и эозином
После 30 дней инкубации все образцы и контроли, изначально назначенные на гистологию, окрашивали гематоксилином и эозином. В положительных контролях морфология была представлена волокнистой тканью, содержащей множество везикул. Таким образом, коллагеновые волокна все еще четко прослеживались в положительных контролях, но большинство нормальных структур хряща исчезало с утратой ВКМ. Коллагеновые волокна были хорошо видны в образцах с 2% ПН.

Тканевые срезы:
окрашивание на коллаген II типа и аггрекан
После 30 дней инкубации все образцы и контроли, изначально назначенные на гистологию, окрашивались с антителами к коллагену II типа и аггрекану.

В клетках, культивированных в питательной среде с 2% ПН, обнаруживались немногочисленные, но четкие нормальные структуры человеческого хряща.

Тканевые срезы:
колориметрический метод окрашивания хрящевого ВКМ альциановым синим
Биоптаты после 30-дневного инкубирования окрашивали альциановым синим. Только в образцах с 2% ПН наблюдался синтез компонентов внеклеточного матрикса (положительное окрашивание альциановым синим), а рост хондроцитов в виде перекрывающихся 3D-слоев (табл. 6). После инкубирования в течение двух часов при комнатной температуре раствор альцианового синего связывал кислые мукополисахариды
и гликопротеины и давал интенсивно синюю окраску ВКМ. Хрящевая ткань, выдержанная in
vitro в течение 30 дней в питательной среде с 2% ПН = диффузная положительная фоновая окраска (оценка = +++).

Тканевые срезы:
колориметрический метод окрашивания хрящевого ВКМ сафранином-О
Биоптаты после 30-дневного инкубирования окрашивали сафранином-О (Sigma) в течение 15 минут при комнатной температуре. Для каждого образца приготавливали специфический контроль. Протеогликаны, мукополисахариды и коллаген II типа окрашивались в кораллово-красный цвет.
После инкубирования в течение 15 минут при комнатной температуре раствор сафранина-О связывался со слизистой субстанцией и окрашивал матрикс в интенсивно красный цвет (табл. 6). Образец 1a, выдержанный в среде с 2% ПН, явственно окрашивался сафранином-О (оценка = +++). Выявлено явное увеличение интенсивности окраски ВКМ, который становился красным в образцах, выдержанных в питательной среде с содержанием 2% ПН по сравнению со всеми другими контролями.

Экстрагирование и количественный анализ ГАГ
Наличие ГАГ обнаруживали спектрофотометром с длиной волны 530 нм. В день 0 данные не регистрировались.

На 30-й день концентрации ГАГ, обнаруженные в условиях культивирования в среде с содержанием 2% ПН, оказались менее сниженными, чем во всех других условиях. В табл. 7 показаны концентрации ГАГ в микрограммах на миллиграмм.

Вместе с тем ни в одном предыдущем исследовании не изучалось воздействие ПН in vitro
на восстановление человеческого хряща и сохранение жизнеспособности хондроцитов с корректным депонированием ВКМ, особенно в сравнении с воздействием ГК на одни и те же биоптаты.
После 30 дней воздействия in vitro 20 хрящевых биоптатов анализировали с целью оценки
фенотипов хондроцитов и корректного синтеза ВКМ. При этом клетки, экстрагированные из хрящевых биоптатов, демонстрировали нормальное депонирование ВКМ, когда их
культивировали в растворе ПН. У хрящей ограничена способность к репарации: из-за того, что хондроциты привязаны к лакунам, они не могут мигрировать к пораженным участкам. Кроме того, гиалиновый хрящ не имеет кровоснабжения, и синтез нового матрикса является медленным. Поврежденный гиалиновый хрящ обычно замещается фиброхрящевой рубцовой тканью. Тип белкового волокна, встроенного в хрящевой матрикс, определяет тип хряща. Фиброзно-волокнистый хрящ – это такой тип хряща, который содержит большое количество волокон коллагена X типа. В отличие от весьма однородного внешнего вида гиалинового хряща, фиброзный хрящ имеет более открытую или губчатую архитектонику с пространствами между лакунами и пучками коллагеновых волокон, как в ранее упомянутом случае хрящевых биоптатов, выдержанных в растворе ГК. В гиалиновом хряще белковые волокна крупные и состоят в основном из коллагена II типа. Оптическая плотность этих волокон одинакова с плотностью окружающего их основного вещества, в результате чего волокна во внеклеточном матриксе не видны. Как следствие, гиалиновый хрящ представляется
весьма однородной стекловидной тканью с хондроцитами, равномерно рассеянными в лакунах.


Более того, во всех биоптатах, выдержанных в растворе 2% ПН (p < 0,001), жизнеспособность клеток была значительно выше. Эти результаты говорят в пользу того, что атрофия хряща, характерная для дегенеративных процессов, является обратимой.


В норме микросреда сустава стимулирует обмен питательных веществ за счет диффузии в особых условиях осмотического давления. Этот механизм способствует тому, что синовиальная жидкость становится вязкой, прозрачной, смазывающей и питательной. В свою очередь, когда синовиальная жидкость, присутствующая в полости, здорова, она позволяет контролировать и поддерживать стабильными некоторые параметры, такие как осмотическое давление, вязкость и питание суставного хряща. С помощью композиций ПН мы попытались воссоздать физиологическую синовиальную жидкость. Новая жидкость испытывалась на хондроцитах без ВКМ in vitro. Культуры клеток, обработанные ПН, депонировали ВКМ de novo и воссоздавали
условия, позволяющие поддерживать формирование здоровой хрящевой ткани. Модель in
vitro полезна для того, чтобы пролить свет на патогенез OA и учесть правильные осмотические и питательные факторы для репарации хряща.

В физиологических условиях микрогравитации и осмоса, используя принцип селективной вязкости в культуре клеток, мы увидели, что ПН пригодны для долговременного культивирования клеток хрящевой ткани in vitro.

Однако наши данные нуждаются в подтверждении клиническими исследованиями in vivo,
учитывающими все биомеханические и патофизиологические переменные, для лучшего
понимания потенциальной эффективности ПН и механизма действия на основе их биологической активности.

ЛИТЕРАТУРА
1. Guvakova MA, Yakubov LA, Vlodavsky I, Tonkinson JL, Stein CA. Phosphorothioate oligodeoxynucleotides bind to basic fibroblast growth factor, inhibit its binding to cell surface receptors, and remove it from low affinity binding sites on extracellular matrix. J Biol Chem 1995; 270:
2620–2627.
2. Sini P, Denti A, Cattarini G, Daglio M, Tira ME, Balduini C. Effect of polydeoxyribonucleotides on human fi broblasts in primary culture. Cell Biochem Funct 1999; 17: 107–114.
3. Guizzardi S, Galli C, Govoni P, et al. Polydeoxyribonucleotide (PDRN) promotes human osteoblast proliferation: A new proposal for bone tissue repair. Life Sci 2003; 73: 1973–1983.
4. Mitsiades CS, Rouleau C, Echart C, et al. Preclinical studies in support of defi brotide for the treatment of multiple myeloma and other neoplasias. Clin Cancer Res 2009; 15: 1210–1221.
5. Altavilla D, Bitto A, Polito F, et al. Polydeoxyribonucleotide (PDRN): a safe approach to induce therapeutic angiogenesis in peripheral artery occlusive disease and in diabetic foot ulcers. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem 2009; 7: 313–321.
6. Valdatta L, Thione A, Mortarino C, Buoro M, Tuinder S. Evaluation of the efficacy of polydeoxyribonucleotides in the healing process of autologous skin graft donor sites: a pilot study. Curr Med Res Opin 2004; 20: 403–408.
7. Richardson PG, Soiff er RJ, Antin JH, et al. Defibrotide for the treatment of severe hepatic veno-occlusive disease and multiorgan failure aft er stem cell transplantation: a multi-center, randomized, dose-finding trial. Biol Blood Marrow Transplant 2010; 16: 1005–1017.
8. Pegram A, Kennedy L. Prevention and treatment of venoocclusive disease. Ann Pharmacother 2001; 35: 935– 942.
9. Falanga A, Vignoli A, Marchetti M, Barbui T. Defi brotide reduces activity and increases fi brinolytic properties of endo-thelial cells. Leukemia 2003; 17: 1636–1642.
10. Palmer KJ, Goa KL. Defi brotide. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic use in vascular disorders. Drugs 1993; 45: 259–294.
11. Cella G, Sbarai A, Mazzaro G, et al. Tissue factor pathway i nhibitor release induced by defi brotide and heparins. Clin Appl Th romb Hemost 2001; 7: 225–228.
12. Coccheri S, Biagi G, Legnani C, Bianchini B, Grauso F. Acute effects of defi brotide, an experimental antithrombotic agent, on fi brinolysis and blood prostanoids in man. Eur J Clin Pharmacol 1988; 35: 151–156.
13. Muratore O, Cattarini G, Gianoglio S, et al. A human placental polydeoxyribonucleotide (PDRN) may promote the growth of human corneal fi broblasts and iris pigmentepithe- lial cells in primary culture. New Microbiol 2003; 26: 13–26.
14. Rubegni P, De Aloe G, Mazzatenta C, Cattarini L, Fimiani M. Clinical evaluation of the trophic eff ect of polydeoxyribo-nucleotide (PDRN) in patients undergoing skin explants. A Pilot Study. Curr Med Res Opin 2001; 17: 128–131.
15. Benimetskaya L, Wu S, Voskresenskiy AM, et al. Angiogenesis alteration by defi brotide: implications for its mechanism of action in severe hepatic veno-occlusive disease. Blood 2008; 112: 4343–4352.
16. Bitto A, Polito F, Irrera N, et al. Polydeoxyribonucleotide (PDRN) reduces cytokine production and the severity of collagen-induced arthritis by stimulation of adenosine A(2A) receptor. Arthritis Rheum 2011; 63: 3364–3371.
17. Shapiro F, Koide S, Glimcher MJ. Cell origin and differentiation in the repair of full-tickness defects of articular cartilage. J Bone Joint Surg 1993; 5: 32–53.
18. Korhonen RK, Han SK, Herzog W. Osmotic loading of insitu chondrocytes in their native environment. Mol Cell Biomech 2010; 7: 125–134.
19. Glowacki J, Yates KE, Maclean R, Mizuno S. In vitro engineering of cartilage: eff ects of serum substitutes, TGF-beta, and IL-1alpha. Orthod Craniofac Res 2005; 8(3): 200–208.
20. Chua KH, Aminuddin BS, Fuzina NH, Ruszymah BH. Insulin-transferrinselenium prevent human chondrocytedediff erentiation and promote the formation of high quality tissue engineered human hyaline cartilage. Eur Cell Mater 2005; 9: 58–67.
21. Pangborn CA, Athanasiou KA. Eff ects of growth factors on meniscal fi brochondrocytes. Tissue Eng 2005; 11(7–8): 1141–1148.
22. French MM, Smith SE, Akanbi K, et al. Expression of the heparan sulfate proteoglycan, perlecan, during mouse embryogenesis and perlecan chondrogenic activity in vitro. J Cell Biol 1999; 145(5): 1103–1115.
23. Laurent TC, Fraser JR. Hyaluronan. FASEB J 1992; 6: 2397–2404.
24. Knudson CB, Knudson W. Cartilage proteoglycans. Semin Cell Dev Biol 2001; 12: 69–78.
25. Knudson CB, Knudson W. Hyaluronan-binding proteins in development, tissue homeostasis, and disease. FASEB J 1993; 7: 1233–1241.
26. Miller EJ. A review of biochemical studies on the genetically distinct collagens of skeletal system. Clin Orthop 1973; 2: 60–80.
27. Nelea V, Luo L, Demers CN, et al. Selective inhibition of type X collagen expression in human mesenchymal stem cell diff erentiation on polymer substrates surface-modified by glow discharge plasma. J Biomed Mater Res A 2005; 75(1): 216–223.
28. Brittberg M, Lindahl A, Nilsson A, et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. New Engl J Med 1994; 31: 89–95.
29. Griffith LG, Naughton G. Tissue engineering-current challenges and expanding opportunities. Science 2002; 295: 1009–1014.
30. Angermann P, Riegels-Nielsen P, Pedersen H. Osteochon- dritis dissecans of the femoral condyle treated with periosteal transplantation. Acta Orthop Scand 1998; 69: 595–597.
31. Grande DA, Pitman MI, Peterson L, Menche D, Klein M. The repair of experimentally produced defects in rabbit articular cartilage by autologous chondrocyte transplanta- tion. J Orthop Res 1989; 7: 208–218.
32. Peterson L, Minas T, Brittberg M, Nilsson A, Sjogren- Jansson E, Lindhal A. Two- to 9-year outcome after autolo- gouschondrocyte transplantation of the knee. Clin Orthop 2000; 374: 212–234.
33. Minas T. Autologous cultured chondrocyte implantation in the repair of focal chondral lesions of the knee: clinical indications and operative technique. J Sports Traumatol 1998; 20: 90–102.
34. MacDessi SJ, Brophy RH, Bullough PG, Windsor RE, Sculco TP. Subchondral fracture following arthroscopic knee surgery. A series of eight cases. J Bone Joint Surg Am 2008; 90(5): 1007–1012.
35. Wenger R, Hans MG, Welter JF, Solchaga LA, Sheu YR, Malemud CJ. Hydrostatic pressure increases apoptosis in cartilage-constructs produced from human osteoarthritic chondrocytes. Front Biosci 2006; 11: 1690–1695.
36. Graham JM, Ayati BP, Ding L, Ramakrishnan PS, Martin JA. Reaction-diffusion-delay model for EPO/TNF-a interaction in articular cartilage lesion abatement. Biol Direct 2012 Feb 21; 7: 9.
37. Lotto ML, Wright EJ, Appleby D, Zelicof SB, Lemos MJ, Lubowitz JH. Ex vivo comparison of mechanical versus thermal chondroplasty: assessment of tissue eff ect at the surgical endpoint. Arthroscopy 2008; 24(4): 410–415.
38. Tuan RS. A second-generation autologous chondrocyte implantation approach to the treatment of focal articular cartilage defects. Arthritis Res Th er 2007; 9(5): 109.
39. Giannini S, Buda R, Vannini F, Di Caprio F, Grigolo B. Arthroscopic Autologous Chondrocyte Implantation in Osteochondral Lesions of the Talus: Surgical Technique and Results. Am J Sports Med 2008; 36(5): 873–880.
40. Riegger-Krugh CL, McCarty EC, Robinson MS, Wegzyn DA. Autologous chondrocyte implantation: current surgery and rehabilitation. Med Sci Sports Exerc 2008; 40(2): 206–214.
41. Nagle JA. Knee joint preservation with autologous cartilage implantation. AORN J 2007; 86(4): 550–562.
42. Gorensek M, Jaksimović C, Kregar-Velikonja N, et al. Nucleus pulposus repair with cultured autologous elastic cartilage derived chondrocytes. Cell Mol Biol Lett 2004;
9(2):363–373.